BIOMEDICINA (CITO/HIST)

CURSO DE BIOMEDICINA – VERGUEIRO – UNIP
PROFESSORA FLORA CORDEIRO
MATERIAL DIDÁTICO PARA AULA PRÁTICA


Aula Prática 1
Instrumentação em Citologia: Uso do Microscópio
Fundamentos Teóricos
A célula, como objetivo de estudo da citologia, pode ser estudada sob diversos aspectos: podemos conhecer sua forma e a de seus constituintes, a natureza química desses constituintes e seu modo de funcionamento. Ou seja, realizar investigações morfológicas, químicas, bioquímicas e fisiológicas, e a cada uma correspondem métodos de estudo particulares.
De uma forma geral, um estudo detalhado da célula e de seus constituintes com a vista desarmada é virtualmente impossível, devido às suas pequenas dimensões. Para se ter uma idéia, as dimensões mais comumente observadas entre as células de animais e vegetais superiores situam-se na faixa de 10 a 20 m (1 m = 10-3 mm; 1 nm = 10-6 mm e 1 Å = 10-1 nm). Por isso o citologista é obrigado a utilizar instrumentos de aumento para a observação conveniente da célula.
Os estudos morfológicos ou morfo-fisiológicos da célula começam normalmente com o emprego do microscópio ótico, também denominado de microscópio fotônico (utiliza a luz como fonte de formação de imagens) ou microscópio composto (por ser constituído por dois sistemas de lentes sobrepostas: a objetiva e a ocular). Este instrumento pode ser considerado como a ferramenta básica e indispensável de todo citologista.
A observação da célula ao microscópio ótico é feita por luz transmitida, que exige que o objeto a ser estudado responda a certas condições. Para que a luz possa atravessá-lo, o objeto deve ser suficientemente fino. Como raramente uma célula apresenta uma espessura na ordem necessária (5 m), torna-se necessário fazer fatias ou cortes da célula para atingir a espessura desejada.
Além da espessura, a observação da célula por luz transmitida requer que certas regiões do objeto absorvam mais luz do que outras, ou seja, que esse objeto apresente contrastes. Como os constituintes celulares têm pouco contraste, é necessário se utilizar de colorações artificiais, usando-se corantes. Os corantes são substâncias que absorvem certos comprimentos de onda da luz visível e têm afinidade por determinados constituintes celulares. Outra maneira possível de se criar contrastes artificialmente é utilizar certas montagens óticas especiais que ampliam as diferenças de contraste existentes nas diversas regiões da célula: microscópio de fase, por exemplo.
O microscópio de luz (figura ao lado) é composto de uma parte mecânica, que serve de suporte, e uma parte óptica, constituída por três sistemas de lentes: o condensador, a objetiva e a ocular.
Condensador: é um sistema ótico de refração, preso à parte inferior do braço sob a platina, podendo ou não possuir movimento vertical (e lateral para centralização), destinado a fazer convergir sobre a preparação a luz proveniente da fonte. A finalidade do condensador é projetar um cone de luz sobre as células que estão sendo examinadas no microscópio. Após atravessar as células esse feixe luminoso, em forma de cone, penetra na objetiva.
Objetiva e Ocular: a objetiva projeta uma imagem aumentada no plano focal da ocular, que novamente a amplia. Por fim, a imagem fornecida pela ocular pode ser projetada na retina (figura ao lado) ou pode ser projetada sobre uma tela ou mesmo uma chapa fotográfica. A ampliação total dada por um microscópio é igual ao aumento da objetiva multiplicado pelo aumento da ocular.
Princípios de formação de imagem
A luz proveniente da fonte luminosa, seja ela direta ou refletida, após atravessar o condensador, é concentrada sobre a preparação. A luz incidente no condensador deve ser paralela para que toda a luz emergente possa convergir no foco daquele sistema ótico. Assim, no caso da existência de espelho, a face plana deve ser utilizada quando a luz for artificial e emitir a luz paralela e a face côncava quando a luz for natural (difusa) ou artificial divergente.
A preparação (objeto) a ser observada deve ter uma espessura reduzida para permitir a transmissão da luz. Cada um de seus pontos funciona como fonte intensa para a formação de imagens pela objetiva.
A objetiva fornece uma imagem real, ampliada e invertida da preparação. A distância focal e o poder de ampliação de uma objetiva são inversamente proporcionais, ou seja, quanto menor for a distância focal da objetiva, maior será seu poder de ampliação.
A imagem fornecida pela objetiva será novamente ampliada pela ocular, funcionando essa imagem, portanto, como “preparação” ou “objeto” para a ocular. Assim, essa lente fornecerá uma imagem virtual, ampliada e direta dessa imagem já formada pela objetiva.
Similarmente à objetiva, a distância focal e o poder de ampliação da ocular são inversamente proporcionais, ou seja, quanto menor for a distância focal de uma ocular, maior será seu poder de ampliação.
Poder de resolução
O poder de resolução de um microscópio fotônico, ou outro instrumento ótico qualquer pode ser definido como a capacidade que este sistema possui de formar imagens distintas e nítidas de dois pontos situados muito próximos em uma preparação. O limite máximo de resolução teórico é, aproximadamente, a metade do comprimento de onda da fonte luminosa. Como o microscópio fotônico usa luz visível (4000-7000 Ǻ ou 400-700 nm), o máximo de poder de resolução deste aparelho estaria em torno de 2000 Ǻ ou 200 nm.
Objetivas de imersão (Abertura numérica de uma objetiva)
Para se aproveitar uma maior quantidade de luz quando a objetiva é de grande aumento (pequeno diâmetro e utilizada a uma distância de trabalho muito pequena), trabalha-se com a lente frontal imersa em um líquido de alta refringência, em geral óleo de cedro (índice de refração de 1,575). Com o emprego desse óleo, pode-se fazer convergir o feixe luminoso proveniente do condensador, captando-se aqueles raios luminosos que, com objetivas secas, seriam perdidos. Estas objetivas são denominadas, objetivas de imersão. A conseqüência direta do emprego dessas objetivas é o aumento da luminosidade.